聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction），簡(jiǎn)稱PCR，是眾所周知的分子生物學(xué)技術(shù)之一。其作為一種通用檢測(cè)技術(shù)，在諸多領(lǐng)域得到應(yīng)用，可以涉及：植物檢疫（植物病蟲害），動(dòng)、植物種類分類鑒定，轉(zhuǎn)基因動(dòng)、植物檢測(cè)、動(dòng)物疫病檢測(cè)，病原微生物檢測(cè)（例如：新冠病毒檢測(cè)）、過敏原檢測(cè)、轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)，瀕危物種鑒定、公安刑偵鑒定，親子鑒定，考古研究、新生兒遺傳疾病篩查、健康人群基因缺陷篩查等檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。

對(duì)于PCR技術(shù)檢測(cè)結(jié)果質(zhì)量的影響因素，目前有很多報(bào)道。綜合起來PCR檢測(cè)質(zhì)量的影響因素可能大致源于人員、儀器、方法、環(huán)境、試劑等五個(gè)方面。本文的關(guān)注重點(diǎn)不是這些質(zhì)量影響因素，而是PCR設(shè)備本身性能對(duì)于檢測(cè)結(jié)果的影響。


參編作者使用不用廠家、不同型號(hào)的PCR儀，對(duì)于PCR儀溫度偏差、溫度均勻性、PCR儀器的恒溫時(shí)間（Hold-Time）等方面進(jìn)行了試驗(yàn)研究和結(jié)果分析。

1 PCR儀溫度準(zhǔn)確性影響的研究

參編作者使用不同基因片段，包括：新冠假病毒片段、轉(zhuǎn)基因玉米MON863基因片段，細(xì)菌毒力基因片段等開展了溫度偏差影響的研究。研究中使用的設(shè)備涉及：7500FAST定量PCR儀(ABI公司、CFX96? Real-Time System（BIO-RAD公司）、Roche 480（羅氏公司）等。研究中使用含以上基因片段的標(biāo)準(zhǔn)品或質(zhì)控品，按照日常檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法或技術(shù)規(guī)范給出的PCR擴(kuò)增程序進(jìn)行目標(biāo)片段的擴(kuò)增。

研究中人為將程序中規(guī)定的溫度調(diào)高或調(diào)低1°C、2°C、3°C、5°C等，模擬反應(yīng)池溫度與規(guī)定值有偏差的反應(yīng)條件，探索其對(duì)擴(kuò)增結(jié)果和Cт值影響。試驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)實(shí)驗(yàn)研究使用的模版濃度較高時(shí)，溫度偏差對(duì)PCR擴(kuò)增效果的影響不明顯。但使用中低濃度模板時(shí)，溫度偏差對(duì)PCR擴(kuò)增效果有影響。

例如，在低濃度樣品濃度的試驗(yàn)研究中，使用含轉(zhuǎn)基因玉米MON863基因片段的標(biāo)準(zhǔn)品，即將MON863質(zhì)粒DNA采用10倍梯度稀釋至濃度為0.8 copies/μL，此時(shí)測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線R2為0.999，擴(kuò)增效率為104%，說明該標(biāo)準(zhǔn)曲線具有良好的線性關(guān)系，因此，選取該濃度水平作為低濃度測(cè)試水平。以此為弱陽性樣品，按照《SN/T 1196-2018 轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)玉米檢測(cè)方法》的規(guī)定的擴(kuò)增程序進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)，對(duì)不同溫度偏差下的CT進(jìn)行匯總和統(tǒng)計(jì)分析后，結(jié)果顯示：對(duì)于AB 7500儀器而言，當(dāng)反應(yīng)程序整體溫度調(diào)高1℃、整體溫度降低1℃、時(shí)，AB 7500儀器檢測(cè)弱陽性樣本CT值存在差異，說明當(dāng)AB 7500儀器溫度變化時(shí)，弱陽性樣本檢測(cè)CT值受到影響。標(biāo)準(zhǔn)程序溫度整體調(diào)高1℃至調(diào)低1℃，弱陽性樣本均檢出，檢出率和結(jié)果判定未受到影響，但是弱陽性樣本檢測(cè)CT值受到影響，說明弱陽性樣本的拷貝數(shù)在一定范圍內(nèi)時(shí)，AB7500儀器的溫度整體變化后檢出率不受影響，但是當(dāng)弱陽性樣本的拷貝數(shù)降低到某個(gè)的臨界值時(shí)，AB7500儀器的溫度整體變化后，弱陽性樣本的檢出率將會(huì)受到影響。

使用CFX96? Real-Time System進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，與上述結(jié)論類似。采用其他片段（新冠病毒基因片段、細(xì)菌StxI基因片段）和儀器（Roche 480）試驗(yàn)后，對(duì)于中低濃度模板的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也呈現(xiàn)上述趨勢(shì)。但對(duì)于雙鏈DNA的擴(kuò)增，在引物和酶充足的情況下，對(duì)溫度的需求比較寬泛，尤其是當(dāng)擴(kuò)增中涉及的溫度點(diǎn)比較少，控溫時(shí)間短的反應(yīng)條件，對(duì)溫度的影響不敏感。

2 溫度均一性對(duì)檢測(cè)結(jié)果影響的研究

為了了解反應(yīng)池不同孔位置差異對(duì)擴(kuò)增效果的影響，即反應(yīng)池不同部位擴(kuò)增效果的差異，參編作者進(jìn)行了溫度均一性影響的測(cè)試。使用轉(zhuǎn)基因玉米MON863基因片段，選取低濃度（0.8copies/μL）的質(zhì)粒DNA溶液作為檢測(cè)樣品，即低濃度模板樣品，樣品放于儀器上可能出現(xiàn)溫度差異的位置，擺放位置為1A、1D、1H、4A、4E、4H、7A、7D、7H、10A、10E、10H、12A、12D、12H，詳細(xì)見圖1，7500FAST定量PCR儀及CFX96? Real-Time System兩個(gè)品牌儀器同時(shí)進(jìn)行了測(cè)試。

樣品擺放位置圖

下表是使用7500 Fast進(jìn)行溫度均一性測(cè)試的結(jié)果，整體來看，A1的CT值與其他位置相比較為最高，H12次之。說明板位的A1、H12與其他位置相比可能存在溫度差異。

橫向?qū)Ρ葋砜矗篈1、A4、A7、A10、A12中A1的CT值最大，A7次之，其他位置相近；D1、D7、D12中，D7的CT值最小，D1、D12相近；E4、E10的CT值相近，且與D7的CT值也相近；H1、H4、H7、H10、H12中H12的CT值最大，H1次之，其他位置相近。結(jié)果說明位于板位中間位置溫度相較于邊緣位置可能更均勻。

縱向?qū)Ρ葋砜矗篈1、D1、H1中A1的CT值最大，D1、H1相近；A4、E4、H4中A4的CT值最大，E4、H4相近；A7、D7、H7中A7的CT值最大，D7、H7相近；A10、E10、H10中A10的CT值最大，E10、H10相近；A12、D12、H12中H12的CT值最大，A12、D12相近。說明縱向來看三個(gè)樣品中中間的樣品CT值有更低的趨勢(shì)，板位的上方位置（A）樣品的CT值相較于其他兩個(gè)位置（D、H）更高，板位上方位置（A）溫度與其他位置可能存在差異。


試驗(yàn)研究表明，在溫度均勻性方面，7500 Fast與CFX96的兩種設(shè)備的試驗(yàn)結(jié)論類似。7500 Fast板位中間溫度具有更均勻的趨勢(shì)，CFX96板位右下方溫度可能與其他位置存在差異，當(dāng)然不排除具體機(jī)器的差異。對(duì)兩種設(shè)備的空間均勻性測(cè)試均表明，反應(yīng)池不同孔位置存在擴(kuò)增效果的差異。在試驗(yàn)中應(yīng)盡量將檢測(cè)樣品置于板位中間位置，減少儀器所造成的系統(tǒng)誤差。

3 PCR儀恒溫時(shí)間（Hold-Time）偏差的影響研究

使用羊全基因組DNA，采用QIAGEN DNeasy Blood & Tissue Kit 試劑盒，提取羊肌肉組織DNA。為了驗(yàn)證恒溫時(shí)間（Hold-Time）對(duì)擴(kuò)增結(jié)果的影響，我們分別對(duì)每臺(tái)PCR儀“變性-退火-延伸”三個(gè)步驟的恒溫時(shí)間（Hold-Time）統(tǒng)一調(diào)整，分別調(diào)整為30s，28s，25s，20s，15s。將上一步5個(gè)批次獲得的擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行測(cè)序分析，測(cè)序由ABI3730儀器完成。將得到的測(cè)序結(jié)果與模板序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，分析擴(kuò)增產(chǎn)物的序列準(zhǔn)確性（是否有基因錯(cuò)配）。

從上表中可以看出，BIOER LifeECO型號(hào)PCR儀在“變性-退火-延伸”三個(gè)步驟的恒溫時(shí)間（Hold-Time）統(tǒng)一調(diào)節(jié)至25s時(shí)已經(jīng)出現(xiàn)明顯擴(kuò)增結(jié)果異常，繼續(xù)下調(diào)至20s、15s時(shí)出現(xiàn)擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)失敗。也就是說，當(dāng)設(shè)定溫度上的恒溫時(shí)間（Hold-Time）明顯小于設(shè)定值（例如按照標(biāo)準(zhǔn)操作程序，變性、退火及延伸設(shè)定值應(yīng)為30s，實(shí)際只有28s、25s、20s、15s時(shí)，即實(shí)際實(shí)驗(yàn)過程中恒溫時(shí)間（Hold-Time）遠(yuǎn)達(dá)不到設(shè)定要求，會(huì)影響變性、退火及延伸等相關(guān)實(shí)驗(yàn)步驟中的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，進(jìn)而造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)不穩(wěn)定狀態(tài)（例如多個(gè)孔位出現(xiàn)基因突變錯(cuò)誤），甚至造成整板樣品的擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)失敗。但不同類型設(shè)備的，在此方面的敏感性，也存在差異。在試驗(yàn)所使用的三種設(shè)備中，Applied Biosystems Veriti Thermal Cycler抗干擾性最強(qiáng)。

由以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以得出PCR儀器的恒溫時(shí)間（Hold-Time）設(shè)定值與實(shí)際值之間偏差過大會(huì)造成對(duì)樣品擴(kuò)增結(jié)果的穩(wěn)定性造成不良影響，甚至導(dǎo)致擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)失敗。因此，需要關(guān)注PCR儀校準(zhǔn)報(bào)告中恒溫時(shí)間（Hold-Time）參數(shù)，如果該參數(shù)設(shè)定值與校準(zhǔn)值偏差過大，需要在后續(xù)PCR實(shí)驗(yàn)過程中通過調(diào)整恒溫時(shí)間（Hold-Time）來進(jìn)行補(bǔ)償。

4 結(jié)論與應(yīng)對(duì)

參編作者通過使用大豆基因片段、細(xì)菌毒力基因片段的擴(kuò)增試驗(yàn)，對(duì)PCR儀溫度偏差影響的試驗(yàn)研究結(jié)果顯示，當(dāng)反應(yīng)程序溫度偏離時(shí)，不論那種設(shè)備，都會(huì)對(duì)擴(kuò)增效果產(chǎn)生響應(yīng)。當(dāng)反應(yīng)程序整體溫度偏差為+1℃時(shí)，相較于標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)程序下相同DNA濃度的CT值，7500 Fast、CFX96、Roche 480都表現(xiàn)為減少，但影響較小。當(dāng)反應(yīng)程序整體溫度偏差為+2℃時(shí)，相較于標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)程序下相同DNA濃度的CT值，有些儀器無目標(biāo)DNA擴(kuò)增，有些仍然能檢出弱陽性樣本，但CT值有顯著變化；當(dāng)反應(yīng)程序溫度偏差為-1℃，實(shí)驗(yàn)中涉及的儀器均能檢出弱陽性樣本。

不同儀器（性能合格）對(duì)于溫度準(zhǔn)確性的響應(yīng)程度有差異，結(jié)果變化方向也不一定一致，可能與不同品牌光源信號(hào)等有關(guān)，但本試驗(yàn)表明7500 Fast 的溫度準(zhǔn)確性偏差為±1℃時(shí)對(duì)弱陽性樣本測(cè)試結(jié)果不產(chǎn)生影響，CFX96 的溫度準(zhǔn)確性對(duì)弱陽性樣本測(cè)試結(jié)果影響不明顯。相較而言，在本試驗(yàn)中7500 Fast比CFX96控溫精度更好。

雖然在使用Roche 480儀器，使用細(xì)菌毒理基因的試驗(yàn)研究結(jié)果顯示，中強(qiáng)度陽性樣本在標(biāo)準(zhǔn)程序溫度整體調(diào)高4℃至調(diào)低9℃，中強(qiáng)度陽性樣本檢出率未受到影響，但是中強(qiáng)度陽性樣本檢測(cè)Ct值受到影響，并且當(dāng)Roche 480儀器的溫度整體變化（從標(biāo)準(zhǔn)程序溫度整體調(diào)高4℃至調(diào)低9℃）后，中強(qiáng)度陽性樣本檢測(cè)Ct值隨著溫度調(diào)高而降低，隨著溫度的調(diào)低而升高，由此推測(cè)，如果做樣本核酸的定量檢測(cè)，樣本核酸的定量檢測(cè)結(jié)果將會(huì)受到影響，即影響到定量檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。在低濃度樣品擴(kuò)增中，同樣顯現(xiàn)了與大豆基因片段相同的趨勢(shì)，即溫度上升或下降后，對(duì)檢測(cè)結(jié)果陰陽性產(chǎn)生了顛覆性影響。

以上結(jié)果說明，不論儀器品牌、型號(hào)如何，對(duì)反應(yīng)程序溫度準(zhǔn)確性都有響應(yīng)。值得關(guān)注的是：不論是大豆基因片段還是細(xì)菌毒力基因片段，無論是何種設(shè)備，在溫度發(fā)生2℃或3℃偏差時(shí)，均對(duì)擴(kuò)增結(jié)果產(chǎn)生的影響，有些時(shí)候是弱陽性樣本不能檢出的顛覆性影響。

由此可見，溫度偏離程序設(shè)定目標(biāo)值，對(duì)PCR擴(kuò)增效果有影響，但影響程度會(huì)因PCR設(shè)備不同廠家、不同型號(hào)有所差異。因此，對(duì)于溫度偏差，設(shè)定多大數(shù)據(jù)作為設(shè)備校準(zhǔn)判定合格與否的臨界值，需根據(jù)設(shè)備品牌、型號(hào)給與不同的考慮。擴(kuò)增程序如果控溫時(shí)間整體較短，程序中溫度的因素相對(duì)影響不大，但該結(jié)論還需更多的數(shù)據(jù)支撐。不同長度的片段在本次實(shí)驗(yàn)中沒有發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增目的片段長度與溫度調(diào)節(jié)敏感性的關(guān)系。

在反應(yīng)池各孔的溫度均勻性方面，無論試驗(yàn)中涉及的哪種品牌、哪種型號(hào)的設(shè)備，也無論是大豆基因片段亦或細(xì)菌毒理基因片段，反應(yīng)板板位中間孔的溫度具有更均勻的趨勢(shì)。

另一方面，參編作者在恒溫時(shí)間（Hold-Time）方面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PCR儀器的恒溫時(shí)間（Hold-Time）設(shè)定值與實(shí)際值之間偏差過大會(huì)對(duì)樣品擴(kuò)增結(jié)果的穩(wěn)定性產(chǎn)生不良影響，甚至導(dǎo)致擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)未檢出目的片段，或擴(kuò)增產(chǎn)物發(fā)生基因錯(cuò)配，從而導(dǎo)致試驗(yàn)失敗。因此，提示使用者應(yīng)同時(shí)關(guān)注恒溫時(shí)間（Hold-Time）及升降溫速率對(duì)擴(kuò)增結(jié)果的影響。

針對(duì)以上研究結(jié)論，提示檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)通過檢測(cè)過程的質(zhì)量控制，及時(shí)發(fā)現(xiàn)上述風(fēng)險(xiǎn)，確保檢測(cè)結(jié)果質(zhì)量。

首先，對(duì)于反應(yīng)板不同孔間不均勻性的影響，建議在試驗(yàn)中盡量將檢測(cè)樣品置于板位中間位置，減少儀器所造成的系統(tǒng)誤差。為了監(jiān)測(cè)和降低該風(fēng)險(xiǎn)，建議在試驗(yàn)中使用弱陽性質(zhì)控，即在邊緣容易產(chǎn)生溫度偏差的孔設(shè)置弱陽性對(duì)照孔，監(jiān)測(cè)擴(kuò)增結(jié)果，若對(duì)照孔出現(xiàn)了擴(kuò)增條帶或CT值的明顯減弱，則提示該批試驗(yàn)結(jié)果不可信。應(yīng)核查孔間溫度均勻性，進(jìn)行設(shè)備維修和調(diào)試。對(duì)于整個(gè)反應(yīng)板的溫度偏離，同樣可采用陽性對(duì)照或弱陽性對(duì)照的方式進(jìn)行檢測(cè)過程的質(zhì)量控制來監(jiān)測(cè)和降低風(fēng)險(xiǎn)。例如，在一個(gè)批次的檢測(cè)中，根據(jù)各專業(yè)具體情況，即陽性、弱陽性對(duì)照品的可獲得性和成本，選取若干孔設(shè)置陽性對(duì)照或弱陽性對(duì)照，監(jiān)測(cè)擴(kuò)增結(jié)果，若對(duì)照孔出現(xiàn)了擴(kuò)增條帶或CT值的明顯減弱，則提示該批試驗(yàn)結(jié)果不可信。

對(duì)于恒溫時(shí)間（Hold-Time）方面的影響，檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室需要關(guān)注PCR儀校準(zhǔn)報(bào)告中恒溫時(shí)間（Hold-Time）參數(shù)，如果該參數(shù)設(shè)定值與校準(zhǔn)值偏差過大，需要在后續(xù)PCR實(shí)驗(yàn)過程中通過調(diào)整恒溫時(shí)間（Hold-Time）來進(jìn)行補(bǔ)償。因此，對(duì)于檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室，PCR儀的定期校準(zhǔn)和期間核查就顯得十分重要。

除以上措施外，同時(shí)建議實(shí)驗(yàn)室定期對(duì)PCR儀進(jìn)行校準(zhǔn)和期間核查，有條件的實(shí)驗(yàn)室和進(jìn)行關(guān)鍵試驗(yàn)之前建議對(duì)PCR儀的全參數(shù)（包括溫度、光源、樣本等）進(jìn)行校準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)室在獲得PCR儀校準(zhǔn)證書后，應(yīng)進(jìn)行校準(zhǔn)結(jié)果的確認(rèn)。即認(rèn)真閱讀和分析各項(xiàng)數(shù)據(jù)，結(jié)合PCR儀日常使用情況，核查和判斷PCR儀是否滿足使用要求。合理制定PCR儀的校準(zhǔn)周期。如果認(rèn)為有必要，還應(yīng)進(jìn)行期間核查，以準(zhǔn)確掌握PCR儀是否具有良好的性能來支撐所有科學(xué)試驗(yàn)。


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